Sezionamento dei tessuti: tecniche, procedure e protocolli del microtomo
La preparazione di sezioni di tessuto di alta qualità per l'istopatologia richiede il rispetto di tecniche, procedure e protocolli specifici, nonché abilità ed esperienza.
La qualità del taglio è fortemente influenzata anche da passaggi precedenti come:
- Fissazione
- Processazione
- Inclusione
La fissazione è la fase più importante nella procedura di preparazione del campione istologico. La durata del fissaggio è importante e varia a seconda della natura del campione biologico in esame, ma soprattutto in base allo spessore del campione stesso.
I tessuti fissati per un tempo insufficiente (underfixed) non saranno adeguatamente protetti dall'azione dei reagenti ed potebbero essere esposti a maggiori artefatti. La fissazione prolungata (overfixed) può compromettere la reattività dei tessuti, soprattutto per quanto riguarda le successive indagini immunoistochimiche.
EMBEDDING DEL TESSUTO CON PARAFFINA
Al termine della processazione il campione viene inserito nei molds e ricoperto di paraffina liquida. Successivamente, si procede con l’inclusione della cassetta con il numero di identificazione del paziente a cui si aggiunge altra paraffina. Il mold viene adagiato su un piano freddo (piastra fredda) in modo da favorirne la solidificazione e la successiva realizzazione del blocco.
TIPI DI STAMPO
- Stampo di carta
- Stampo in metallo
- Stampo dimmock
- Stampo usa e getta (plastica)
- Stampo in metallo o plastica utilizzato per cassette ad anello (F) o cassette standard (G)
ORIENTAMENTO LAMA DEL MICROTOMO
L'angolo di inclinazione della lama impedisce il contatto tra la superficie della lama e la superficie del blocco.
L'angolo affilato è l'angolo tra le due facce che compongono la superficie di taglio.
ORIENTAMENTO DEL CAMPIONE
L'orientamento delle cassette è molto importante e può avere un forte impatto sul taglio e sulla possibilità di ottenere una "striscia" di sezioni.
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Nella maggior parte dei laboratori tutte le cassette vengono inserite nel morsetto allo stesso modo (es. con l'etichetta a sinistra per l'orientamento est-ovest, o in alto per l'orientamento nord-sud). Occorre quindi considerare l'orientamento del campione rispetto alla lama già in fase di inclusione. Esistono opinioni diverse in merito all'orientamento ottimale per alcuni tipi di campioni. I microtomi Diapath Galileo Series 2 sono inoltre dotati di un sistema di orientamento di precisione con comandi che consentono di trovare facilmente la posizione zero o una variabile misurabile sull'asse x / y. Questa funzione è molto utile quando si tagliano blocchi preparati in altri laboratori o su altri microtomi, dove è richiesto un allineamento preciso per evitare la perdita di tessuto
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Nella routine di taglio di più blocchi, è importante che il portacampione sia impostato su zero su entrambi gli assi prima di iniziare il sezionamento.
RETRAZIONE
La retrazione è una caratteristica che offre vantaggi in fase di sezionamento, oltre ad allungare la vita della lama. Se si utilizza un microtomo che integra la possibilità di retrazione, la parte anteriore del blocco deve essere allineata con la superficie di taglio mentre il blocco è in corsa discendente (in posizione avanzata, non retratto)
SGROSSAMENTO DI TESSUTI
Prima di iniziare a tagliare, assicurarsi sempre che tutti i meccanismi di bloccaggio siano in sicurezza. Lo sgrossamento di un blocco ha lo scopo di esporre completamente il tessuto incluso in paraffina al fine di ottenere una sezione rappresentativa preservandone le caratteristiche morfologiche
SEZIONAMENTO AL MICROTOMO: FATTORI CHE INFLUENZANO LO SPESSORE
Il microtomo può essere impostato liberamente, ma è importante tenere presente la persenza di alcuni fattori che determinano l'effettivo spessore della sezione.
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Lo spessore di una sezione può essere condizionato da vari fattori, come la velocità di rotazione, l'angolo di inclinazione del gruppo lame e lo stato della lama
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La temperatura del blocco è uno dei fattori più importanti che influenzano lo spessore e la qualità di una sezione
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Anche il tipo di blocco di tessuto (morbido o duro) influisce sullo spessore soprattutto durante il taglio.
RISOLUZIONE DEI PROBLEMI DI MICROTOMIA
Utilizzare una parte della lama diversa da quella utilizzata per lo sgrossamento e se la parte anteriore del blocco si riscalda, potrebbe essere necessario raffreddare ulteriormente il blocco.
Generalmente i migliori risultati con la minima compressione si ottengono con un taglio lento e uniforme. Non interrompere e riavviare un processo di taglio, perché lungo la sezione si formeranno bande di diverso spessore
Prima di tagliare ogni sezione, in alcuni laboratori è normale soffiare leggermente sulla parte anteriore del blocco raffreddato.
Se un blocco è difficile da tagliare perché duro o friabile, la superficie può essere immersa in un bagnetto stendifette con acqua fredda o in un agente emolliente, come un ammorbidente o un detergente delicato.
Per i campioni a base di calcio è possibile ottenere sezioni applicando un agente disincrostante al tessuto esposto per 10 minuti o più. Se la consistenza del campione compromette fortemente il taglio, soprattutto quando il campione è troppo morbido, è necessaria una rielaborazione del campione.